一、細菌學檢查：
嗜血桿菌屬革蘭氏陰性桿菌，培養(yǎng)條件顯示多形性特征，易染性，此菌無芽孢，無運動。
1．鏡檢：從軟下疳開放性潰瘍?nèi)〔耐科瑯吮救旧趴死资妊讬z出，未破潰病灶從膿腫或橫痃中穿刺，取其穿刺液涂片標本染色也易檢出，更為典型，用美藍染色或革蘭氏染色等鏡檢用10×；100倍油浸觀察。
2．培養(yǎng)檢查：軟下疳菌分離培養(yǎng)較為困難，故在采取病變材料時應(yīng)注意取軟下疳潰瘍邊緣下貯留膿汁或穿刺橫痃抽吸的膿汁作為檢體，或再用生理鹽水充分洗滌潰瘍底面后，再用生理鹽水濕棉簽涂抹標本送化驗室培養(yǎng)。
國際上軟下疳的標準培養(yǎng)基一種是GCHGS（Hammondgonococcalmedia），由淋球菌瓊脂培養(yǎng)基加牛血紅蛋白、胎牛血清、萬古霉素及纖維素、氨基酸等組成；另外一種是MHHb（Muller-Hinton瓊脂，由Muller-Hinton瓊脂、馬血、萬古霉素及其他培養(yǎng)成份組成），上述兩種培養(yǎng)基可以同時應(yīng)用，以提高陽性率。
菌落常于接種后24-48小時形成。色灰黃而透亮，直徑約為1-2mm。從菌落處取材作革蘭染色陰性，為成雙的短桿菌，成鏈狀排列。同時應(yīng)作生化反應(yīng)以鑒定之。主要有：氧化酶試驗弱陽性，過氧化酶試驗陰性，非卟啉試驗陰性，硝酸鹽還原試驗陽性，鹼性磷酸酶試驗陽性。
杜克雷嗜血桿菌的培養(yǎng)不僅有助于診斷，而且可確定分離的細菌對抗生素的敏感性，目前已分離出耐抗生素的杜克雷嗜血桿菌。
二、血清學診斷軟下疳
感染桿克雷嗜血桿菌能產(chǎn)生抗體，通過血清學檢查，不論是補體結(jié)合，凝集反應(yīng)以及熒光抗體間接法等均可證實，但尚未推廣，目前認為IgM抗體敏感性為74%，IgG抗體敏感性為94%，其特異性分別為84%和64%。
三、PCR檢測杜克雷嗜血桿菌。
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