尖銳濕疣是感染人類乳頭瘤病毒（HPV）而引起的一種表皮瘤樣增生。尖銳濕疣的診斷多根據(jù)皮疹特點(diǎn)、發(fā)病部位、發(fā)展情況結(jié)合可能詢及的接觸史來判斷，但少數(shù)病人要進(jìn)行一些輔助實(shí)驗(yàn)來確診。具體實(shí)驗(yàn)診斷方法介紹如下：
一、醋酸白試驗(yàn)
用3-5%醋酸外涂疣體2-5分鐘，病灶部位變白稍隆起，肛門病損可能需要15分鐘。本試驗(yàn)的原理是蛋白質(zhì)與酸凝固變白的結(jié)果，HPV感染細(xì)胞產(chǎn)生的角蛋白與正常的未感染上皮細(xì)胞產(chǎn)生的不同，只有前者才能被醋酸脫色。醋酸白試驗(yàn)檢測HPV的敏感性很高，它比常規(guī)檢測觀察組織學(xué)變化還好。但偶爾在上皮增厚或外傷擦破病例中出現(xiàn)假陽性、假陽性變白跡象顯得界限不清和不規(guī)則。美國CDC提示，醋酸白試驗(yàn)并不是特異試驗(yàn)，且假陽性較常見。
二、免疫組織學(xué)檢查
常用過氧化物酶抗過氧化物酶方法（即PAP），顯示濕疣內(nèi)的病毒蛋白，以證明疣損害中有病毒抗原。HPV蛋白陽性時，尖銳濕疣的淺表上皮細(xì)胞內(nèi)可出現(xiàn)淡紅色的弱陽性反應(yīng)。
三、組織化學(xué)檢查
取少量病損組織制成涂片，用特異抗人類乳頭瘤病毒的抗體作染色。如病損中有病毒抗原，則抗原抗體結(jié)合。在過氧化物酶抗過氧化物酶（PAP）方法中，核可被染成紅色。此法特異性強(qiáng)且較迅速，對診斷有幫助。
四、病理檢查
主要為角化不全，棘層高度肥厚，乳頭瘤樣增生，表皮突增厚，延長，其增生程度可似假性上皮瘤樣。刺細(xì)胞和基底細(xì)胞并有相當(dāng)數(shù)量的核分裂、頗似AI-G變。但細(xì)胞排列規(guī)則，且增生上皮和真皮之間界限清楚。其特點(diǎn)為粒層和刺層上部細(xì)胞有明顯的空泡形成。此種空泡細(xì)胞較正常大，胞漿著色淡、中央有大而圓，深嗜堿性的核。通常真皮水腫、毛細(xì)血管擴(kuò)張以及周圍較致密的慢性炎性浸潤。Bushke-loewenstein巨大型尖銳濕疣，表皮極度向下生長，代替了其下面的組織、易與鱗狀細(xì)胞相混，故須多次活檢。若有緩慢發(fā)展之傾向，則為一種低度惡變的過程，即所謂疣狀A(yù)I-G。
五、基因診斷
迄今，HPV難于用傳統(tǒng)的病毒培養(yǎng)及血清學(xué)技術(shù)檢測，主要實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)是核酸雜交。近年來發(fā)展的PCR方法具有特異、敏感、簡便、快速等優(yōu)點(diǎn)，為HPV檢測開辟了新途徑。
�。ㄒ唬�(biāo)本的采集及處理
1.標(biāo)本的采集和預(yù)處理：用刮板或生理鹽水浸潤的棉棒從陰道和宮頸外口取分泌物和細(xì)胞。在作細(xì)胞學(xué)檢查的同時，將標(biāo)本放入5ml含有0.05%硫柳汞的PBS中，用PBS離心（3000g，10min）洗滌2次，沉積細(xì)胞重懸于1mlPBS中，取0.5ml細(xì)胞懸液抽提。
2.標(biāo)本核酸的提取：按1體積細(xì)胞懸液加10倍體積的細(xì)胞裂解液（10mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，10mmol/L EDTA，150mmol/L NaCl，0.4%SDS，1.0mg/ml蛋白酶K）37℃下處理過夜;且等體積酚/氯仿（1:1），氯仿/異戊醇（24:1）各抽提2次;加1/10體積3mol/L NaAc（pH 5.2）及2.5倍體積無水乙醇置-20℃ 2h或過夜沉淀DNA;加1體積乙醇洗滌1次;用60μl含RNA酶（100μg/ml）的TE液（10mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，1.0mmol/L EDTA）溶解DNA，37℃溫育。
�。ǘ㏄CR擴(kuò)增
1. 引物設(shè)計和合成：HPV基因組可分為早期區(qū)（E）和晚期區(qū)（L），每區(qū)含一系列開放讀碼框架（ORF）。序列分析表明，各型HPV的非編碼區(qū)及E1、E6、E7和L1區(qū)均有保守序列。Manos等從HPVL1區(qū)中選擇保守序列設(shè)計合成引物MY11和MY09見表1，該引物與HPV 6、11、16、18及33型有互補(bǔ)序列，也可擴(kuò)增其它型。
2.PCR反應(yīng)試劑：Taq DNA聚合酶（2U/ml）、10mmol/L dNTP貯備液（dATP、dCTP、dGTP、dTTP各10mmol/L），10×PCR緩沖液（500mmol KCl、40mmol/L MgCl2、100mmol/L Tris-HCl、pH 8.5），100μmol/L MY11和MY09貯備液，滅菌的玻璃蒸餾器制備的蒸餾水。
3.PCR擴(kuò)增方法和程序：以100μl PCR反應(yīng)液，用無菌0.5ml硅化塑料離心管為反應(yīng)管進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。
�。�1）實(shí)驗(yàn)前配制預(yù)混反應(yīng)試劑并分裝。預(yù)混反應(yīng)試劑包括除標(biāo)本DNA外的其它各種PCR反應(yīng)試劑。每支反應(yīng)管中含有的PCR反應(yīng)試劑。
�。�2）各反應(yīng)管依次加入10μl標(biāo)本和90μl預(yù)混反應(yīng)試劑。
�。�3）加入80-100μl石蠟油，在臺式離心機(jī)上快速離心數(shù)秒鐘，使各反應(yīng)試劑收集于油層下。目前，PCR試劑已商品化，反應(yīng)體積為25μl。使用時只加入標(biāo)本DNA即可。
�。�4）將反應(yīng)管置PCR擴(kuò)增儀上，循環(huán)參數(shù)為95℃ 30s，55℃ 40s，72℃ 50s循環(huán)35次，最后72℃延伸5min。
4.每次試驗(yàn)應(yīng)設(shè)陽性及陰性對照。以載有HPV的重組質(zhì)粒（每反應(yīng)為100pg）或含有HPV的細(xì)胞系（如癌ski、HeLa）DNA為陽性對照，以無HPV的人細(xì)胞系DNA為陰性對照。
�。ㄈ⿺U(kuò)增產(chǎn)物的檢測和分析
1. 凝膠電泳：擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取出反應(yīng)管，冷卻至室溫，取10μl擴(kuò)增產(chǎn)物用5%-7%聚丙烯酰胺凝膠或1.5%瓊脂糖電泳，溴化乙錠染色，紫外分析儀下分析結(jié)果，分子量約為450bp處出現(xiàn)明顯的DNA帶。
2. 核酸雜交：如果凝膠電泳無清楚的DNA或需確定DNA帶的特異性時，可用標(biāo)記的公用混合探針和（或）型特異探針作Southern吸印雜交、斑點(diǎn)雜交驗(yàn)證。
按照標(biāo)準(zhǔn)方法制32P ATP標(biāo)記的寡核苷酸探針，需達(dá)到約107cpm/pmol特異活性。雜交液中需含有2×106-5×106cpm探針/ml。在55℃緩慢振蕩下雜交2-3h，隨后于30-55℃下用洗滌液（2×SSC、0.1%SDS）迅速沖洗雜交膜，除去多余探針。然后進(jìn)行洗膜，其條件依所用探針而異：公用混合探針，55℃洗膜10min;MY12、MY13及MY16探針，56-57℃下10 min，并換液重洗1次;MY14及WD74探針，58-59℃下10min，亦換液重洗1次。
用PCR方法檢測HPV比核酸雜交方法優(yōu)越。其敏感性高，GP-PCR方法以凝膠電泳直接分析結(jié)果，可檢出標(biāo)本中200個拷貝的HPV DNA，若以核酸雜交檢測PCR產(chǎn)物，敏感性提高，能檢出10個拷貝的HPV DNA。
鑒于PCR技術(shù)的高度敏感性，以生殖道脫落細(xì)胞為檢材足以滿足試驗(yàn)要求，避免了活檢取材、研磨組織繁雜操作。一般情況下，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳，觀察產(chǎn)生的DNA可直接作出診斷。因此，PCR技術(shù)檢測HPV實(shí)驗(yàn)周期短、簡便快速。
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